當(dāng)FITC在堿性溶液中與抗體蛋白反應(yīng)時(shí)，主要是蛋白質(zhì)上賴(lài)氨酸的r氨基與熒光素的硫碳胺鍵（thiocarbmide）結(jié)合，形成FITC-蛋白質(zhì)結(jié)合物，即熒光抗體或熒光結(jié)合物。一個(gè)IgG分子中有86個(gè)賴(lài)氨酸殘基，一般zui多能結(jié)合15～20個(gè)，一個(gè)IgG分子可結(jié)合2～8個(gè)分子的FITC，其反應(yīng)式如下：

FITC-N=C=S  +  N-H2-蛋白質(zhì)  →  FITC-NS-C-N-H2-蛋白質(zhì)

常用Marsshall（1958）法標(biāo)記熒光抗體，也可以根據(jù)條件采用Chadwick等標(biāo)記法或Clark等（1963）的透析標(biāo)記法。

 

1.Marsshall法

（1）材料：抗體球蛋白溶液、0.5mol／L（pH9.0）碳酸鹽緩沖液、無(wú)菌生理鹽水、異硫氰酸熒光素、1％硫柳汞水溶液、50ml小燒杯、4℃冰箱、電磁攪拌器、透析袋、玻棒、pH7.2或3.0的0.01mol／LPBS等。

（2）方法及步驟   

①抗體的準(zhǔn)備：取適量已知濃度的球蛋白溶液于燒杯中，再加人生理鹽水及碳酸鹽緩沖液，使zui后免疫球蛋白濃度為20mg／ml，碳酸鹽緩沖液容量為總量的1／10，混勻，將燒瓴置電磁攪拌器上（速度適當(dāng)以不起泡沫為宜）5～10min。

②熒光素的準(zhǔn)備：根據(jù)欲標(biāo)記的蛋白質(zhì)總量，按每毫克免疫球蛋白加0.01mg熒光色素，用分析天平準(zhǔn)確稱(chēng)取所需的異硫氰酸熒光素粉末。也可用下述公式計(jì)算出免疫球蛋白、熒光素的量，還可以算出需加緩沖液的量。

a.蛋白溶液：含量Amg／m1；容積Bml。

b.總蛋白量（AXB）＝Crag。

c.C／20～C／10＝Dmg（如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20）。

d.熒光素FITC的量：（1／50～2／100）XC＝Emg。

e.巳0.5mol／L（pH9.5）碳酸鹽緩沖液D／10＝Fml。

f. PBS量D-（B+F）=Gml。

注：A為蛋白含量，mg／ml；B為蛋白質(zhì)溶液的容積；C為蛋白總量，mg；D為常數(shù)，mg；正為熒光素的量，mg；F為碳酸鹽緩沖液的容積，ml；G為PBS的容積，ml。

③結(jié)合（或標(biāo)記）：邊攪拌邊將稱(chēng)取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中，避免將熒光素粘于燒瓶壁（大約在5—10min內(nèi)加完），加完后，繼續(xù)避光攪拌12h左右。結(jié)合期間應(yīng)保持蛋白溶液于4℃左右，故需將燒杯和攪拌器一起移人4℃冰箱中。

④透析：結(jié)合完畢后，將標(biāo)記的球蛋白溶液離心（2500r／min）20rain，除去其中少量的沉淀物，裝入透析袋中，再置于燒杯中，用pH8.0緩沖鹽水透析（0～4~C）過(guò)夜。

⑤過(guò)柱：取透析過(guò)夜的標(biāo)記物，通過(guò)葡聚糖凝膠SephadexG-25或G—50柱，分離游離熒光素，收集標(biāo)記的熒光抗體進(jìn)行鑒定。洗脫液：0.01mol／L磷酸鹽緩沖液（pH7.2）；過(guò)濾量：12ml標(biāo)記蛋白液（過(guò)濾前未透析）；收集量：20ml（稀釋1.7倍左右）。

 

2.Chadwick法

（1）試劑和材料：抗體球蛋白溶液、異硫氰酸熒光素、3%碳酸鈉水溶液、0.01mol/L pH8.0PBS、1%硫柳汞、離心機(jī)及離心管、燒杯（25ml）攪拌器、無(wú)菌吸管，無(wú)菌吸管及毛細(xì)滴管、燒杯（500ml）透析袋等。

（2）方法及步驟

①抗體準(zhǔn)備：用o～4~C的pH8。0磷酸鹽緩沖鹽水將球蛋白溶液稀釋至濃度為30～40mg／ml，置入25ml燒杯內(nèi)，放于冰槽中。

②熒光色素準(zhǔn)備：按每毫克免疫球蛋白加入熒光素0.01rug計(jì)算，稱(chēng)取所需的熒光素，用3％碳酸鈉水溶液溶解。

③將準(zhǔn)備的抗體與熒光色素溶液等量混合，充分?jǐn)噭颍趏～4~C冰箱中結(jié)合（在磁力攪拌機(jī)上持續(xù)攪拌）18～24h。

④透析和柱層析：方法同Marsshall法。

 

3.改良法

（1）試劑和材料

①0.01mol／L（pH7.2）PBS配法中，校定pH至7.2。NaCi 18g、Na2HP04 1.15g，溶于2000ml蒸餾水

②0.5mol／L（pH9.0）碳酸鹽緩沖液配法  取0.5mol／LNazCOs（5.3％）10ml加入0.5mol／LNaHC03（4.2％）90ml，混合后，校定pH至9.0。

③3％碳酸鈉水溶液配法  稱(chēng)L 5g無(wú)水碳酸鈉充分溶解于50ml滅菌蒸餾水中即成。

④其他試劑和材料  l％*、離心機(jī)及離心管、燒杯（25m1）、攪拌器、無(wú)菌吸管及毛細(xì)滴管、燒杯（500m1）透析袋等。

（2）方法及步驟   

①取價(jià)的抗人球蛋白兔免疫血清，分離球蛋白，用鹽水（0.15mol／LNaCl）及緩沖液（0.5mol／LNaHC03—Na2C03，pH9.0）稀釋使每毫升內(nèi)含蛋白質(zhì)lOmg，緩沖液為總量的10％，降溫至4℃。

②加入異硫氰酸鹽（FITC）熒光素[蛋白：熒光素＝（50—80）mg/mg]，在0～4℃。

下電磁攪拌12～14h。

③然后用半飽和的硫酸銨將標(biāo)記球蛋白沉淀分離，除去未結(jié)合的熒光素，再用緩沖鹽水透析，除去硫酸銨（用Nessler試劑測(cè)驗(yàn)，至隔夜透析的鹽水無(wú)氨離子及熒光色素為止）。

④將制備好的熒光抗體加*o.01％，分裝在lml安瓿中，或凍干，保存于冰箱中（4℃）可以用半年以上，一20~C保存可達(dá)2年以上。

 

4.透析標(biāo)記法

 

此法適用于小量抗體的熒光素標(biāo)記，標(biāo)記簡(jiǎn)便，非特異性染色較少。

（1）試劑和材料：試劑和材料同改良法。

（2）方法及步驟

①用0.025mol／L碳酸鹽緩沖液pH9.0，將欲標(biāo)記免疫球蛋白稀釋成1％濃度，裝入透析袋中。

②用同一緩沖液將FITC配成0.1mg／ml的溶液，按10mg／ml球蛋白溶液體積的10倍，將FITC稀釋液盛于圓柱形容器內(nèi)，并使透析袋浸沒(méi)于FITC液中。

③容器頂端蓋緊，底部放攪拌棒，在4~C電磁攪拌下透析標(biāo)記24h。取出透析袋中標(biāo)記液，即刻用SephadexG50凝膠過(guò)濾，去除游離熒光素，分裝，貯存于4℃中。