凋亡試劑盒廣泛應(yīng)用于各種傳染性疾病的篩查，如肝炎、HIV，也可應(yīng)用優(yōu)生優(yōu)育等。的試劑、良好的儀器和正確的操作是保證凋亡試劑盒實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠的必要條件。試驗(yàn)中若不做好相關(guān)控制，易出現(xiàn)白板、花板、色弱和假陽(yáng)性等現(xiàn)象。尤其是花板現(xiàn)象(空白、陰性、陽(yáng)性對(duì)照以及室內(nèi)質(zhì)控孔結(jié)果正常，而標(biāo)本孔的OD值卻明顯偏高)是各級(jí)臨床實(shí)驗(yàn)室常遇到的問(wèn)題。現(xiàn)將凋亡試劑盒操作中的影響因素總結(jié)如下：
 

　　1.標(biāo)本因素
 

　　以辣根過(guò)氧化物酶(HRP)為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中，殘留在孔內(nèi)的血紅蛋白具有過(guò)氧化物酶樣活性，催化底物顯色造成假陽(yáng)性；混有紅細(xì)胞的血清易沉淀或附著在聚乙烯孔內(nèi)不易洗凈；如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)；標(biāo)本凝固不全，在臨床試驗(yàn)中，有時(shí)為了爭(zhēng)取時(shí)間而快速檢測(cè)，常在血液還未開(kāi)始凝固時(shí)即強(qiáng)行離心分離血清，使血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測(cè)定過(guò)程中可以形成肉眼可見(jiàn)的纖維蛋白塊，易造成假陽(yáng)性結(jié)果；采血試管洗滌不*、反復(fù)使用易交叉污染；塑料試管能吸附抗原物質(zhì)，樣本久置在塑料管內(nèi)會(huì)使樣本內(nèi)抗原含量下降造成假陰性。
 

　　因此血清標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測(cè)，禁用嚴(yán)重溶血的標(biāo)本。一般說(shuō)來(lái)，在5 d內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可放置于2～8℃，標(biāo)本在冰箱中保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易導(dǎo)致血清IgG聚合，使間接法的試劑本底加深。超過(guò)1周測(cè)定的需-20℃保存。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻并避免產(chǎn)生氣泡。混濁或有沉淀的血清標(biāo)本應(yīng)先離心或過(guò)濾，澄清后再檢測(cè)。反復(fù)凍融會(huì)使抗體效價(jià)跌落，所以測(cè)抗體的血清標(biāo)本如需保存做多次檢測(cè)，宜少量分裝冰存；使用一次性玻璃試管或真空采血管；并使用非抗凝標(biāo)本，肝素抗凝血漿會(huì)增加OD值，可能與高濃度肝素具有強(qiáng)大的負(fù)電荷，能吸附酶標(biāo)記物，不易洗脫有關(guān)；EDTA、酶抑制劑(如NaN3)可抑制凋亡試劑盒系統(tǒng)中辣根過(guò)氧化物酶活性；血液標(biāo)本采集后必須使其充分凝固后再分離血清，或標(biāo)本采集時(shí)用帶分離膠或一次性真空促凝采血管。
 

　　2.試劑因素
 

　　凋亡試劑盒試劑經(jīng)歷了從合成肽向基因工程抗原的過(guò)渡。由于歷史的原因，人們往往以反應(yīng)本底的好壞來(lái)衡量凋亡試劑盒。因此，有些廠(chǎng)家為了保持較好的本底而采用了單片段基因工程抗原及合成肽包被，該類(lèi)試劑盒的流行病學(xué)敏感度不夠，穩(wěn)定性也成問(wèn)題。也有廠(chǎng)家堅(jiān)持試劑盒高的流行病學(xué)敏感度，科學(xué)地對(duì)待反應(yīng)結(jié)果。基因工程抗原較合成肽抗原有無(wú)抗原決定簇的肽片段；二代產(chǎn)品包被的抗原既有基因工作抗原又有合成肽，只是當(dāng)時(shí)的基因工程抗原不全，僅包括了HCV的核心區(qū)片段；第三代產(chǎn)品基本上采用了基因工程抗原，而且這些抗原包括更多、更穩(wěn)定、純度更高的HCV特異性抗菌素原。第三代試劑的敏感度大大提高了。基因工程抗原與合成肽抗原的區(qū)別如下：
 

　　基因工程抗原是抗菌素原基因在質(zhì)粒載體中原核或真核表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌或酵母為表達(dá)系統(tǒng)。該類(lèi)抗原與合成肽相比具有以下特點(diǎn)。①分子量大。合成肽采用化學(xué)方法制備，由于工藝的局限，合成數(shù)量有限，只能達(dá)到數(shù)百個(gè)氨基酸；而利用基因工程制備的抗菌素原，分子量更大。②穩(wěn)定性好。包被抗原的穩(wěn)定性決定試劑盒的有效期，早期以合成肽為包裝抗原的試劑盒有效期只有3～4個(gè)月，改作基因工程抗原后有效期大大延長(zhǎng)了。③基因工程抗原將特異性抗原決定簇基因融合表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物包含更多的抗原決定簇，可提高試劑盒的靈敏度，提高檢出率。④純化難度大。基因工程抗原的純化技術(shù)難度較大。合成多肽抗原是根據(jù)蛋白質(zhì)抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。合成肽抗原有以下特點(diǎn)：分子量太小；一般只含有一個(gè)抗原決定簇；純度高；穩(wěn)定性差。